细胞形态异常

辅助试剂

人为操作/环境

微生物污染

耗材

培养基

细胞层面

支原体
支原体污染时细胞培养基可能依然清澈或呈微黄色。支原体是一种细胞培养实验中极其常见的污染物, 发生的概率>50%。支原体常见于人体皮肤、呼吸道、生殖道和消化道, 消毒不完全的器具也易带入支原体进入培养体系。由于它们非常小(0.15-0.3um),增长速度相对于细菌比较缓慢,污染时不容易用常规方法发现。
支原体会全方位影响到细胞形态、增殖、基因表达与蛋白合成及代谢反应。同时因为抽提到的DNA/RNA与蛋白可有高达30~50%为支原体来源,会造成QPCR或WesternBlot实验结果的偏差。

Biological Industies(BI)可提供: 支原体检测/处理/预防全套解决方案
1. 支原体污染检测试剂盒 EZ-PCR Mycoplasma Test Kit,Cat No.:20-700-20,
2. 支原体污染处理试剂Mycoplasma Treatment Reagent

BIOMYC-1 Antibiotic Solution 100X,Cat No.:03-036-1B/C
BIOMYC-2 Antibiotic Solution 100X,Cat No.:03-037-1B/C
BIOMYC-3 Antibiotic Solution 100X,Cat No.:03-038-1B/C
3. 支原体、细菌、真菌污染预防喷雾剂Pharmacidal,Cat No.: IC-110100
4. Aquaguard-1,Cat No.: 01-867-1B 100ml,有效消毒二氧化碳培养箱中的水盘
5. Aquaguard-2,Cat No.: 01-916-1E 50ml,有效消毒任何形式的水浴环境

Dr. Cell可提供: 支原体污染检测, Cat No.: T80100001

解决方法
细菌
细菌污染时细胞培养基可能呈黄色/白色混浊,可能造成细胞增殖缓慢或型态上的改变(多角、多核等),细胞质中产生空泡、细胞不附着、培养基观察到不正常的pH值变化, 在显微镜观察下看到背景有大量黑点,可从异物的大小、形态、运动与否来判断是否为细菌污染。
产品名称_中文名称产品名称_英文名称货号作用种类备注
两性霉素B, 250mg/mlAmphotericin B03-028-1B真菌、酵母菌和霉菌对新生隐球菌、白色念珠菌、组织胞浆菌、球孢子菌、酿母菌均具抑制作用
两性霉素B, 2500mg/mlAmphotericin B03-029-1B
制真霉素, 10000units/mlNystatin Suspension03-030-1C真菌、酵母菌和霉菌消化道念珠菌肠炎,口腔念珠菌感染
青链双抗(青霉素-链霉素)Penicillin-Streptomycin03-031-1B对革兰氏阳性菌G+,革兰氏阴性菌G-葡萄球菌、链球菌、杆菌 etc.
青链双抗(青霉素-链霉素) 10X浓缩Penicillin-Streptomycin03-031-5B
青链霉素,制真菌素三抗Penicillin-Streptomycin-Nystatin Solution03-032-1B真菌、酵母菌和霉菌、G+、G- 
青链霉素,两性霉素B三抗Penicillin-Streptomycin-Amphotericin B Solution03-033-1B真菌、酵母菌和霉菌、G+、G-
青链霉素,新霉素三抗Penicillin-Streptomycin-Neomycin Solution03-034-1B真菌、酵母菌和霉菌、G+、G-
硫酸庆大霉素溶液, 50mg/mlGentamicin Sulfate Solution03-035-1B对革兰氏阳性菌,革兰氏阴性菌,支原体
卡那霉素溶液, 10mg/mlKanamycin Sulfate Solution03-049-1B对革兰氏阳性菌,革兰氏阴性菌,支原体
解决方法
真菌、霉菌
类似棉花絮状的漂浮物可能是真菌污染。这类的污染在早期并不会使得培养基变黄,但在显微镜下可观察到菌丝体。
产品名称_中文名称产品名称_英文名称货号作用种类备注
两性霉素B, 250mg/mlAmphotericin B03-028-1B真菌、酵母菌和霉菌对新生隐球菌、白色念珠菌、组织胞浆菌、球孢子菌、酿母菌均具抑制作用
两性霉素B, 2500mg/mlAmphotericin B03-029-1B
制真霉素, 10000units/mlNystatin Suspension03-030-1C真菌、酵母菌和霉菌消化道念珠菌肠炎,口腔念珠菌感染
青链双抗(青霉素-链霉素)Penicillin-Streptomycin03-031-1B对革兰氏阳性菌G+,革兰氏阴性菌G-葡萄球菌、链球菌、杆菌 etc.
青链双抗(青霉素-链霉素) 10X浓缩Penicillin-Streptomycin03-031-5B
青链霉素,制真菌素三抗Penicillin-Streptomycin-Nystatin Solution03-032-1B真菌、酵母菌和霉菌、G+、G- 
青链霉素,两性霉素B三抗Penicillin-Streptomycin-Amphotericin B Solution03-033-1B真菌、酵母菌和霉菌、G+、G-
青链霉素,新霉素三抗Penicillin-Streptomycin-Neomycin Solution03-034-1B真菌、酵母菌和霉菌、G+、G-
硫酸庆大霉素溶液, 50mg/mlGentamicin Sulfate Solution03-035-1B对革兰氏阳性菌,革兰氏阴性菌,支原体
卡那霉素溶液, 10mg/mlKanamycin Sulfate Solution03-049-1B对革兰氏阳性菌,革兰氏阴性菌,支原体
解决方法
病毒
在型态上容易观察到细胞病变(CPE, cytopathic effect),可能呈现细胞碎片增多、肿大、圆缩、脱落、大量悬浮聚集在培养基中,严重时可在细胞单层上观察到局部破损空斑(Plaque)。病毒污染概率相对较低,需种属配对才能增殖。

可选用辐照血清以避免带进任何活的微生物进入培养体系。如 BI, Certified Foetal Bovine Serum Gamma-irradiated FBS, 货号:04-111-1A

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      Before infection                                              After 24 hours infection


解决方法
黑胶虫
目前科学界对黑胶虫(Swimming black dots)并无定论,应该是由不同种属的微生物污染现象的一种俗称、通称。
通常观察到呈卵园状或球杆状小黑点,在培养基中可观察到活跃的布朗运动以及明显的增殖现象,具有细胞毒作用可引起细胞生长变缓甚或裂解和凋亡,会出现在人及哺乳动物的细胞培养体系中。
如果会游动则通常是某种微生物污染,如果不会游动,有可能是由培养基与血清中之胎球蛋白(Fetuin
)或碳酸磷灰石(Carbonate Apatite )沉淀形成。
参考文献:
1. “Nanobacteria are
Mineralo Fetuin(胎球蛋白) Complexes” - Didier Raoult, Patricia Renesto et al. PLoS Pathogens. 2008 Feb., 4(2): e41
2. “Membrane Vesicles Nucleate
Mineralo-organic Nanoparticles and induce Carbonate Apatite Precipitation in Human Body Fluids” - Cheng-
Yeu Wu, John D. Young et al. The Journal of Biolocal Chemistry. 2013 Oct., 288(42): 30571-30584
3.“Got black swim

Dr. Cell可提供: 黑胶虫样本鉴定, Cat No.: T80600001
目前检测的黑胶虫样本,实际上62%为细菌,38%为支原体

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解决方法
细胞株交叉污染
细胞株间的交叉污染常发生在不经易之间。由于实验操作的疏失(不同细胞株分盘时, 共享一瓶培养基、枪头、移液管忘记更换)而造成不同细胞株间的混合污染, 或是实验操作人员误植错误细胞株名称(继代时的培养皿, 冷冻细胞时的冷冻小管)。因为此问题非常严重,大部分的科学期刊已要求如有用到细胞做实验,均需附上"细胞鉴定报告"才可能发表文章。

Dr. Cell可提供:
1. 人源细胞系STR鉴定 (STR Authentication
) , Cat No.: T80200001  
以下情况需要做STR鉴定:1). 实验室建立新的细胞系  2). 细胞来源于组织 – 原代细胞 3). 细胞功能不正常 4). 文章发表 5). 常规定期鉴定
2. 细胞物种鉴定 (Species Identification) -15种常见模式动物的鉴定, Cat No.: T80300001
可检测人(Human,Homo sapiens)、小鼠(Mouse,Mus musculus)、大鼠(Rat, Rattus norvegicus)、中国仓鼠(Chinese Hamster,Cricetinae griseus)、猕猴(Rhesus Monkey,Macaca mulatta)、猪(Pig,Sus scrofa)、牛(Bovine,Bos Primigenius taurns)、狗(Dog,Canis lupus familiaris)、 猫(Cat,Felis Silivestris catus)、马(Horse,Equus ferus caballus)、兔(Rabbit,Oryctolagus cuniculus)、鸡(Chicken,Gallus gallus)、果蝇(Fruit Fly,Drosophilidae melanogaster)、斑马鱼(Zebra Fish,Danio rerio)、非洲绿猴(Green Monkey,Cercopithecus aethiopes)15个种属来源的细胞,判断样本是否存在这15个种属间的交叉污染。

解决方法
酵母菌
成串的珠狀物形态呈卵形。体积比细胞小 5~10 倍。污染严重时,会造成培养基pH值改变, 不易除去。当其行出芽生殖时可从一大一小的连体结构识别。
产品名称_中文名称产品名称_英文名称货号作用种类备注
两性霉素B, 250mg/mlAmphotericin B03-028-1B真菌、酵母菌和霉菌对新生隐球菌、白色念珠菌、组织胞浆菌、球孢子菌、酿母菌均具抑制作用
两性霉素B, 2500mg/mlAmphotericin B03-029-1B
制真霉素, 10000units/mlNystatin Suspension03-030-1C真菌、酵母菌和霉菌消化道念珠菌肠炎,口腔念珠菌感染
青链双抗(青霉素-链霉素)Penicillin-Streptomycin03-031-1B对革兰氏阳性菌G+,革兰氏阴性菌G-葡萄球菌、链球菌、杆菌 etc.
青链双抗(青霉素-链霉素) 10X浓缩Penicillin-Streptomycin03-031-5B
青链霉素,制真菌素三抗Penicillin-Streptomycin-Nystatin Solution03-032-1B真菌、酵母菌和霉菌、G+、G- 
青链霉素,两性霉素B三抗Penicillin-Streptomycin-Amphotericin B Solution03-033-1B真菌、酵母菌和霉菌、G+、G-
青链霉素,新霉素三抗Penicillin-Streptomycin-Neomycin Solution03-034-1B真菌、酵母菌和霉菌、G+、G-
硫酸庆大霉素溶液, 50mg/mlGentamicin Sulfate Solution03-035-1B对革兰氏阳性菌,革兰氏阴性菌,支原体
卡那霉素溶液, 10mg/mlKanamycin Sulfate Solution03-049-1B对革兰氏阳性菌,革兰氏阴性菌,支原体
解决方法
操作人员

 人体表面平均带有103-106/cm2的微生物, 污染物可能由于操作人员及穿着的衣物带入。进出细胞房需穿着合适的实验衣, 尽量降低粉尘、皮屑及附带之微生物的扬起及掉落, 以免造成污染 

人是带菌者,进细胞房应该:
勤更衣:无菌无尘衣穿过六小时后已于可在每平方公分中采集到个1-6个微生物
少讲话:口水中每毫升含107个微生物。应戴口罩操作

解决方法
细胞房
无净化的室内空气每立方公尺可检测到500 – 2000 个浮游菌。
2015药典指导原则9205药品洁净实验室微生物监测和控制指导原则,里面有规定不同洁净等级的浮游菌和沉降菌的数量要求。
细胞房内绝对不可穿拖鞋或凉鞋, 以避免带入脚气霉菌。应该穿全包裹式鞋套,或专用鞋子。

1. 按要求细胞房应为封闭、正压、洁净房间(1-10级万洁净度) 。如受限于现况,可考虑医疗用移动式空气净化机,以净化空气。
2. 如担心污染物外泄,细胞房还应设计为相对负压。
3. 人员进出细胞房应有管制,经过培训才能进入操作,避免污染别人。

解决方法
生物安全柜
生物安全柜需尽量保持清洁及净空,非必要性的物品不要放在里面, 容易扰乱操作柜内气流。使用前一定要使用消毒杀菌溶液进行擦拭 (如75%酒精或Pharmacidal), 使用完也需要进行消毒并且UV处理20分钟以上。
生物安全柜与超净工作台的高效滤网(HEPA filter)滋生细菌后反而容易成为污染源,良好的操作环境,才能确保细胞的健康。

BI可提供: 支原体/细菌/真菌污染预防喷雾剂Pharmacidal,Cat No.: IC-110100
定期更换生物安全柜与超净工作台HEPA滤网, 检测风速与测漏

解决方法
显微镜置物台
使用显微镜观察细胞时, 放置细胞培养皿或是培养瓶的载物平台与桌面, 也须保持干净, 以免造成交叉污染

Biological Industies(BI)可提供:
支原体/细菌/真菌污染预防喷雾剂Pharmacidal,Cat No.: IC-11010
0

解决方法
二氧化碳培养箱
1. 培养箱内的CO2与温湿度需定期校正, 这些都是与细胞的生长息息相关的因子;
2. 培养箱的温湿度非常适合微生物生长, 需定期消毒培养箱腔体与不锈钢隔架, 水盘用水需灭菌并加入抑菌剂, 杜绝霉菌真菌滋生。

Biological Industies(BI)可提供: 
1. 支原体/细菌/真菌污染预防喷雾剂Pharmacidal,Cat No.: IC-110100
2. Aquaguard-1,Cat No.: 01-867-1B 100ml,有效消毒培养箱中的水盘

3. 选购可灭菌的二氧化碳培养箱,定期灭菌。

解决方法
水浴锅
水浴锅是细胞房中很容易滋生细菌与霉菌的设备, 培养瓶体在回温的过程中容易沾附污染源随处传播, 并且带入生物安全操作柜等环境中。

水浴锅中应加入无菌超纯水,并加入抑菌剂,可选用Biological Industies(BI):Aquaguard-2,Cat No.: 01-916-1E 50ml,有效消毒任何形式的水浴环境

解决方法
震动
细胞刚传代或是复苏时, 如受到震荡摇晃会造成贴壁迟缓, 甚至会有聚集成团的状况。

应避免在培养箱中或是周围有震动或离心设备。

解决方法
灭菌锅
所有仪器与设备均需定期保养与校准以维持正常的性能。
灭菌效果不达标

定期做BD(Bowie Dick)测试, 确保压力、温度与时间均符合灭菌要求

解决方法
胰酶
1.一旦发生消化时间逐渐拉长, 或是细胞消化不下来, 需注意是否胰酶已经失活。由于胰酶是属于蛋白质类产品, 反复冻融容易影响其活性。一般胰酶保存方式, 建议15或50毫升分装后-20℃冻存、使用前必须37℃水浴或培养箱回温、胰酶消化后使用不含钙镁的缓冲液清洗细胞。
2.品质不佳的胰酶也容易带入支原体或动物性污染源, BI所生产的胰酶经过辐射照射处理, 确保品质及有效杜绝支原体的引入。
3.临床培养可选用重组胰酶,以避免引入未知动物源病原体

一般胰酶保存方式, 建议15或50毫升分装后-20℃冻存、使用前必须37℃水浴或培养箱回温,胰酶消化后使用不含钙镁的缓冲液清洗细胞。

产品名称货号
Trypsin Solution B (0.25%), without Calcium and Magnesium, without Phenol Red
胰蛋白酶(不含钙和镁,不含酚红,不含EDTA)
03-046-1A
Trypsin Solution B (0.25%), without Calcium and Magnesium, without Phenol Red
胰蛋白酶(不含钙和镁,不含酚红,不含EDTA)
03-046-1B
Trypsin Solution B (2.5%), 10X Conc., without Calcium and Magnesium, without Phenol Red
胰蛋白酶(不含钙和镁,不含酚红,10倍浓缩液)
03-046-5B
Crystalline Trypsin Solution (0.02%), without Phenol Red
水晶胰酶(不含钙和镁,不含酚红,不含EDTA)
03-047-1A
Crystalline Trypsin Solution (0.02%), without Phenol Red
水晶胰酶(不含钙和镁,不含酚红,不含EDTA)
03-047-1B
Trypsin EDTA Solution A (0.25%), EDTA (0.02%), with Phenol Red
胰酶(胰蛋白酶0.25%,EDTA0.02%)
03-050-1A
Trypsin EDTA Solution A (0.25%), EDTA (0.02%), with Phenol Red
胰酶(胰蛋白酶0.25%,EDTA0.02%)
03-050-1B
Trypsin EDTA (0.5%),  EDTA 0.2% , 10X Conc, without Phenol Red
胰酶,不含酚红,10倍浓缩液
03-051-5B
Trypsin EDTA Solution B (0.25%), EDTA  (0.05%), with Phenol Red
胰酶(胰蛋白酶0.25%,EDTA0.05%)
03-052-1A
Trypsin EDTA Solution B (0.25%), EDTA  (0.05%), with Phenol Red
胰酶(胰蛋白酶0.25%,EDTA0.05%)
03-052-1B
Trypsin EDTA Solution C (0.05%), EDTA (0.02%), with Phenol Red
胰酶(胰蛋白酶0.05%,EDTA0.02%)
03-053-1A
Trypsin EDTA Solution C (0.05%), EDTA (0.02%), with Phenol Red
胰酶(胰蛋白酶0.05%,EDTA0.02%)
03-053-1B
Trypsin EDTA Solution C (0.05%), EDTA (0.02%), without Phenol Red
胰酶(胰蛋白酶0.05%,EDTA0.02%,无酚红)
03-054-1A
Trypsin EDTA Solution C (0.05%), EDTA (0.02%), without Phenol Red
胰酶(胰蛋白酶0.05%,EDTA0.02%,无酚红)
03-054-1B
解决方法
缓冲液
PBS及DPBS是常见的洗涤缓冲液。在胰酶消化之前使用PBS洗涤残留的完全培养基,是常见的操作,(因为完全培养基内的血清含有抑制胰酶的蛋白)。如果是对于一些更难消化细胞,则必须使用不含Ca,Mg离子的PBS,因为这些离子也会抑制胰酶的活性。
从正规供应商处购买以确保品质: 如渗透压、无菌等。

02-015-1ACS "Hanks' Balanced Salt Solution,With Calcium and Magnesium With Phenol Red HBSS平衡盐溶液(含钙,镁和酚红)"
 02-023-1ACS "Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS), without Calcium and Magnesium DPBS(不含钙,镁和酚红)"
02-023-5A "Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS), 10X Conc., without Calcium and Magnesium DPBS缓冲液(不含钙,镁和酚红,10倍浓缩液)"
02-024-1ACS "Phosphate Buffered Saline (PBS), PH=7.4, without Calcium and Magnesium PBS(不含钙,镁和酚红)"
02-024-5ACS "Phosphate Buffered Saline (PBS), PH=7.4, without Calcium and Magnesium,10X Conc. PBS缓冲液(不含钙,镁和酚红,10倍浓缩液)"

解决方法
冻存液
细胞解冻复苏时,不宜在冷冻管内悬浮太久, 需尽快转移至培养基中。
细胞的状态如不佳, 可提高培养基内血清的比率, 隔天就更换培养基, 置换掉含有DMSO的培养基。也有可能有些细胞本身冷冻后存活率不佳或冷冻时的细胞數较少。如以上都有注意到, 就必须了解是否冷冻细胞时的手法有问题, 需注意是否程序性降温。

BI可提供: 
1. 无血清细胞冻存液Serum-Free Cell Freezing Medium
, Cat No.:  05-065-1A/B
2. 无血清干细胞冻存液CryoStem Freezing Medium,  Cat No.: 05-710-1D/
3. 无血清间充质干细胞冻存液MSC Freezing Solution, Cat No.:05-712-1D/E 

解决方法
抗生素
细胞在体内是无菌状态生长,一般细胞株的常规培养,非必要时应避免添加抗生素。
已知抗生素对细胞有不同影响,如:
1. β-内酰胺类抗生素(青霉素)- 会影响蛋白质合成及抑制细胞增殖;
2. 氨基糖苷类氨基糖类(链霉素,卡那霉素,庆大霉素) - 会减少蛋白质合成,ATP水平降低,产生细胞毒性;
3. 内酯类(两性霉素B / fungizone,制霉菌素) - 干扰细胞膜,产生细胞毒性。

使用抗生素的时机:
1. 原代细胞培养时。因为在从组织分离时易带入污染;
2. 观察到,并且确认是微生物污染时(去除微生物后, 即应停用抗生素);
3. 尽量避免使用抗生素作为预防的方法

解决方法
移液管
不同细胞株分盘时, 枪头、移液管需要一次性更换, 以免造成交叉污染

做为一种低概率事件,不同类型的耗材其未达到灭菌(即可能含菌)的概率从1/1000-1/1,000,000。
这种随机发生的低概率事件是最难追踪调查与预防的。

解决方法
培养瓶
1. 培养瓶属于一次性更换耗材, 重复使用将可能造成细胞污染或是细胞无法贴盘, 老化、过度活化等等不稳定结果;
2. 塑料耗材从模具取下时可能会带下硅油,影响到细胞生长;
3. 大部分生产耗材车间不是洁净厂房,耗材有可能会夹带异物。

请考察并选用品质稳定、质量达标的耗材,并要求生产商提供测试数据报告

解决方法
培养皿/培养孔盘
质量较差的培养耗材底面在显微放大观察下可能凹凸不平, 造成细胞贴壁的分散不一致, 在凹处形成聚集现象。

请考察并选用品质稳定、质量达标的耗材,并要求生产商提供测试数据报告

解决方法
血清
由于批号不同,血清内成分和营养含量百分比会不同,细胞会需要适应。因此有些批号适合养神经细胞或间充质干细胞等。
更换血清批号时:
1. 建议少量置换,1/3,1/2,2/3渐进式更换;
2. 或是提高血清比例增加营养让细胞更快速适应;
3. 一次采购足量血清避免经常更换批号;
4. 还须注意是否购买到仿冒的血清, 请务必从正规经销商购买, 如遇过于低廉的价格与不明通路都需提高警觉(未经过冷链全程运送)

Biological Industies(BI)有各式胎牛血清, 特殊加工工艺胎牛血清, 新生牛血清、成牛血清和其它物种血清(猪、马、羊、兔)等。

解决方法
基础培养基
干粉培养基: 自行配置时, 需注意是否另外添加营养物或必须物至培养基中(eg.碳酸氢钠需特别注意)并调整pH。
液态培养基: 使用不正确/不匹配培养基细胞仍可生长, 只是特性会改变。
培养基中常用的pH指示剂:酚红(phenol red),其实本身有微弱的雌激素(estrogen)作用,刺激有雌激素受体的细胞增殖。

BI有多种不同细胞专用无血清培养基系统, 及各式基础培养基, 请洽各地负责经销商或与技术支持部谘询

解决方法
添加因子
在临床及临床前研究所需高质量之细胞培养及分化试验,时常需要外加细胞因子,建议最好选购不含动物和人衍生物质的高活性及高纯度之重组蛋白,以确保产品符合严格规范之活性及标准化。
常见使用的添加因子如:细胞因子(Cytokine),这是一类小分子蛋白质或多肽类,这些因子可以帮助细胞的生长,促进细胞活化,直接参与免疫调节作用和其他细胞因子的形成,也是细胞与细胞之间讯息传递的重要桥梁。在正常生理况下细胞受到刺激后也会自然分泌,不同种类的细胞因子也会具有不同的免疫功能,然而过度的细胞因子分泌也可能会引发炎症反应,可直接、间接诱导或抑制细胞凋亡。
一此动物来源、组分複杂的添加剂,如Matrigel®,批间差比全合成或单一组分试剂大,使用时必须小心注意。

VivaCell 有各类科研与临床级别细胞因子、荷尔蒙、小分子化合物等, 请洽各地负责经销商或与技术支持部咨询
Vitrogel 与BioLamina均为合成与组分固定的试剂,实验结果更一致,重复性高。

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BioLamina                                                       Vitrogel

解决方法
光照
光线中的紫外线会破坏培养基中的Hepes, 核黄素与色氨酸, 形成过氧化氢自由基, 对细胞造成毒害作用。

如需长时间观察细胞, 如Live cell imaging, 可选用CELL Guidance Systems: LiveLightTM光稳定培养基系列:
1. MEMO培养基(取代DMEM), Cat No.: M06-100/M06-500
2. NEUMO培养基(取代Neurobasal), Cat No.: M07-100/M07-500
3. SOS补充剂(取代B-27), Cat No.: M09-20/M09-50

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用470nm的光进行光遗传基因操纵实验。常规培养基(DMEM+SATO)内几乎所有OPC(oligodendrocyte progenitor cell,少突胶质前体细胞)都死亡,然而LiveLight培养基里的OPC细胞仍有良好活性。


解决方法
谷氨酰胺
不同的细胞培养, 培养基中都需加入一定量的谷氨酰胺,作为培养细胞的能量来源,参与蛋白质的合成和核酸代谢。谷氨酰胺缺乏会导致细胞生长不良甚至死亡。谷氨酰胺在溶液中经过一段时间后会降解, 谷氨酰胺的降解导致氨的形成,而氨对于一些细胞具有毒性。加有谷氨酰胺的培养液在4℃冰箱中储存2周以上时,应重新加入谷氨酰胺。或可选用添加了长效型的谷氨酰胺培养基。

Biological Industies(BI)可提供:
1. 长效型谷氨酰胺 L-Alanly-L-Glutamine, Cat No.: 03-022-1B
2. 各式细胞培养辅助试剂, 请洽各地负责经销商或与技术支持部咨询 

解决方法
人为选择/突变
细胞在体外培养时,实际持续经受着人为的选择,如:1. 胰酶消化是一种反复的人为选择过程,易被消化的细胞才会被传代; 2. 细胞过度的分化及刺激时可能造成异常的突变。如 HeLa cell虽然还保有人的基因序列, 但染色体数曾被观察到有异常突变增加(原HeLa为46条, 目前有观察到70-90条染色体的案例);
3. hES 细胞株已被证实原位癌基因(TP53)随着代数增加更易有突变产生 
参考文献: “Human pluripotent stem cells recurrently acquire and expand dominant negative P53 mutations” - Florian T. Merkle et al.,  Nature volume 545, pages 229–233 (11 May 2017)

为保障实验材料的一致性, 应将长期使用的细胞株建立细胞种子库(Seed Stock)与工作库(Working Stock)并定期安排身分鉴定

解决方法
老化
细胞只要持续生长分裂就会发生老化的现象; 无论是原代细胞或是细胞株 (immortalized cell line)。老化细胞的几个特征: 细胞分裂减少(增殖变慢)、细胞大小异常增大, 甚至显微镜下可以观察到四核到八核的多核现象。
如果在继代的过程发现这样的细胞变多了, 表示细胞已老化。老化的细胞还不会立刻死亡, 而会随着继代一直留在细胞群之中,经过一些时间之后才会发生细胞凋亡(时间长的可以到一两年)。老化的细胞基因表达谱会产生变化, 建议从种子库或工作库重新复苏。

Dr. Cell可提供: 细胞老化检测(Cell Senescence Detection),Cat no.: T80500001
细胞老化检测可准确地判断出老化细胞的百分比,以决定是否要使用代数更低的细胞,以维持实验材料的一致性。

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衰老细胞                                                                 正常细胞

解决方法
细胞冻存/复苏
复苏细胞的原则为快速解冻,为避免冰晶对细胞造成伤害。 细胞复苏后,约需數日或是传代一至二代,其细胞生长或特性表现才会恢复稳定与正常, 通常复苏情况的好坏与存活率的高低是和冷冻时的程序与手法息息相关。

掌握"慢冻快融"的原则,进行程序降温。

慢冻: 两种方法:

1.手动程序降温,将细胞依序放在4℃(30分钟)、-20℃(1小时)、-80℃(过夜)后移至液氮中保存。

2.程序降温盒,一般最广泛使用的降温法,为一种特制冷冻容器(填充异丙醇或依靠特制金属导热),使细胞以每分钟约-1℃的速度降至-80℃(过夜),然后移至液氮中保存。

快融:将冻存在液态氮中的细胞冻存管快速移至已37℃预热的水浴锅中(水面需低于管口,避免水分意外进入冻存管),使细胞冷冻悬液迅速融化;此做法能让细胞冷冻悬液快速通过-20℃~0℃这个结晶形成温度范围,使冻存时细胞外的冰晶迅速融化,避免冰晶进入细胞形成再结晶,对细胞造成二次伤害。
Biological Industies(BI)可提供: 
1. 无血清细胞冻存液Serum-Free Cell Freezing Medium, Cat No.: 05-065-1A/B
2. 无血清干细胞冻存液CryoStem Freezing Medium, Cat No.: 05-710-1B/E 
3. 无血清间充质干细胞冻存液 MSC Freezing Solution, Cat No.: 05-712-1B/E

解决方法
传代密度过低
细胞与细胞之间会有黏附及通信的作用发生(Cell-Cell Adhesion and Communication)参与细胞的识别,细胞的活化和信号转导, 并且增殖时会分泌能够促进生长的生长因子形成有利于生长的环境。一旦传代的密度过低, 两者皆会造成增殖速度迟缓或死亡。

细胞传代时, 要确实的执行细胞计数, 确保铺盘的密度。

解决方法
融合度过高才传代(>90%)
可能会造成细胞黏着的改变(adhesion): 细胞除了会跟基质产生黏附, 细胞与细胞之间也有黏附作用, 一旦细胞的融合度过高才进行传代, 细胞可能会产生老化现象。甚至某些细胞融合度太高的话, 会堆栈造成聚集(aggregates)而不再是单层细胞。这种改变常常是不可逆的, 即便再重新铺盘进行传代, 细胞却再也回不来原本的样子了(eg.培养时总是有空隙, 还没养满就堆栈)

尽量避免融合度过高, 融合度约达到80%即可分盘
Confluence 融合度: 在细胞培养中指的是细胞在培养表面(培养皿/瓶)所占的比例。

解决方法
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鱼骨图是一种分析问题产生的质量管理手法,此鱼骨图分析造成细胞形态发生异常时的几个主要原因,依次为微生物污染、细胞层面、人为操作/环境、培养基、辅助试剂、耗材等。逍鹏生物(XP Biomed)技术支持部门并提供了一系列解决方案,帮助研究人员解决实验上的问题。按鱼骨的近到远及鱼刺的大到小,相应表示问题发生的概率由大到小,使用者可按图索骥,排查造成细胞培养异常的原因及对策。
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