
辅助试剂

人为操作/环境

微生物污染

耗材

培养基

细胞层面
支原体会全方位影响到细胞形态、增殖、基因表达与蛋白合成及代谢反应。同时因为抽提到的DNA/RNA与蛋白可有高达30~50%为支原体来源,会造成QPCR或WesternBlot实验结果的偏差。
Biological Industries(BI)可提供: 支原体检测/处理/预防全套解决方案
1. 支原体污染检测试剂盒 EZ-PCR Mycoplasma Test Kit,Cat No.:20-700-20,
2. 支原体污染处理试剂Mycoplasma Treatment Reagent
BIOMYC-1 Antibiotic Solution 100X,Cat No.:03-036-1B/C
BIOMYC-2 Antibiotic Solution 100X,Cat No.:03-037-1B/C
BIOMYC-3 Antibiotic Solution 100X,Cat No.:03-038-1B/C
3. 支原体、细菌、真菌污染预防喷雾剂Pharmacidal,Cat No.: IC-110100
4. Aquaguard-1,Cat No.: 01-867-1B 100ml,有效消毒二氧化碳培养箱中的水盘
5. Aquaguard-2,Cat No.: 01-916-1E 50ml,有效消毒任何形式的水浴环境
Dr. Cell可提供: 支原体污染检测, Cat No.: T80100001
产品名称_中文名称 | 产品名称_英文名称 | 货号 | 作用种类 | 备注 | ||
两性霉素B, 250mg/ml | Amphotericin B | 03-028-1B | 真菌、酵母菌和霉菌 | 对新生隐球菌、白色念珠菌、组织胞浆菌、球孢子菌、酿母菌均具抑制作用 | ||
两性霉素B, 2500mg/ml | Amphotericin B | 03-029-1B | ||||
制真霉素, 10000units/ml | Nystatin Suspension | 03-030-1C | 真菌、酵母菌和霉菌 | 消化道念珠菌肠炎,口腔念珠菌感染 | ||
青链双抗(青霉素-链霉素) | Penicillin-Streptomycin | 03-031-1B | 对革兰氏阳性菌G+,革兰氏阴性菌G- | 葡萄球菌、链球菌、杆菌 etc. | ||
青链双抗(青霉素-链霉素) 10X浓缩 | Penicillin-Streptomycin | 03-031-5B | ||||
青链霉素,制真菌素三抗 | Penicillin-Streptomycin-Nystatin Solution | 03-032-1B | 真菌、酵母菌和霉菌、G+、G- | |||
青链霉素,两性霉素B三抗 | Penicillin-Streptomycin-Amphotericin B Solution | 03-033-1B | 真菌、酵母菌和霉菌、G+、G- | |||
青链霉素,新霉素三抗 | Penicillin-Streptomycin-Neomycin Solution | 03-034-1B | 真菌、酵母菌和霉菌、G+、G- | |||
硫酸庆大霉素溶液, 50mg/ml | Gentamicin Sulfate Solution | 03-035-1B | 对革兰氏阳性菌,革兰氏阴性菌,支原体 | |||
卡那霉素溶液, 10mg/ml | Kanamycin Sulfate Solution | 03-049-1B | 对革兰氏阳性菌,革兰氏阴性菌,支原体 |
产品名称_中文名称 | 产品名称_英文名称 | 货号 | 作用种类 | 备注 | ||
两性霉素B, 250mg/ml | Amphotericin B | 03-028-1B | 真菌、酵母菌和霉菌 | 对新生隐球菌、白色念珠菌、组织胞浆菌、球孢子菌、酿母菌均具抑制作用 | ||
两性霉素B, 2500mg/ml | Amphotericin B | 03-029-1B | ||||
制真霉素, 10000units/ml | Nystatin Suspension | 03-030-1C | 真菌、酵母菌和霉菌 | 消化道念珠菌肠炎,口腔念珠菌感染 | ||
青链双抗(青霉素-链霉素) | Penicillin-Streptomycin | 03-031-1B | 对革兰氏阳性菌G+,革兰氏阴性菌G- | 葡萄球菌、链球菌、杆菌 etc. | ||
青链双抗(青霉素-链霉素) 10X浓缩 | Penicillin-Streptomycin | 03-031-5B | ||||
青链霉素,制真菌素三抗 | Penicillin-Streptomycin-Nystatin Solution | 03-032-1B | 真菌、酵母菌和霉菌、G+、G- | |||
青链霉素,两性霉素B三抗 | Penicillin-Streptomycin-Amphotericin B Solution | 03-033-1B | 真菌、酵母菌和霉菌、G+、G- | |||
青链霉素,新霉素三抗 | Penicillin-Streptomycin-Neomycin Solution | 03-034-1B | 真菌、酵母菌和霉菌、G+、G- | |||
硫酸庆大霉素溶液, 50mg/ml | Gentamicin Sulfate Solution | 03-035-1B | 对革兰氏阳性菌,革兰氏阴性菌,支原体 | |||
卡那霉素溶液, 10mg/ml | Kanamycin Sulfate Solution | 03-049-1B | 对革兰氏阳性菌,革兰氏阴性菌,支原体 |
可选用辐照血清以避免带进任何活的微生物进入培养体系。如 BI, Certified Foetal Bovine Serum Gamma-irradiated FBS, 货号:04-111-1A
Before infection After 24 hours infection
通常观察到呈卵园状或球杆状小黑点,在培养基中可观察到活跃的布朗运动以及明显的增殖现象,具有细胞毒作用可引起细胞生长变缓甚或裂解和凋亡,会出现在人及哺乳动物的细胞培养体系中。
如果会游动则通常是某种微生物污染,如果不会游动,有可能是由培养基与血清中之胎球蛋白(Fetuin)或碳酸磷灰石(Carbonate Apatite )沉淀形成。
参考文献:
1. “Nanobacteria areMineralo Fetuin(胎球蛋白) Complexes” - Didier Raoult, Patricia Renesto et al. PLoS Pathogens. 2008 Feb., 4(2): e41
2. “Membrane Vesicles NucleateMineralo-organic Nanoparticles and induce Carbonate Apatite Precipitation in Human Body Fluids” - Cheng-Yeu Wu, John D. Young et al. The Journal of Biolocal Chemistry. 2013 Oct., 288(42): 30571-30584
3.“Got black swim
Dr. Cell可提供: 黑胶虫样本鉴定, Cat No.: T80600001
目前检测的黑胶虫样本,实际上62%为细菌,38%为支原体
Dr. Cell可提供:
1. 人源细胞系STR鉴定 (STR Authentication) , Cat No.: T80200001
以下情况需要做STR鉴定:1). 实验室建立新的细胞系 2). 细胞来源于组织 – 原代细胞 3). 细胞功能不正常 4). 文章发表 5). 常规定期鉴定
2. 细胞物种鉴定 (Species Identification) -15种常见模式动物的鉴定, Cat No.: T80300001
可检测人(Human,Homo sapiens)、小鼠(Mouse,Mus musculus)、大鼠(Rat, Rattus norvegicus)、中国仓鼠(Chinese Hamster,Cricetinae griseus)、猕猴(Rhesus Monkey,Macaca mulatta)、猪(Pig,Sus scrofa)、牛(Bovine,Bos Primigenius taurns)、狗(Dog,Canis lupus familiaris)、 猫(Cat,Felis Silivestris catus)、马(Horse,Equus ferus caballus)、兔(Rabbit,Oryctolagus cuniculus)、鸡(Chicken,Gallus gallus)、果蝇(Fruit Fly,Drosophilidae melanogaster)、斑马鱼(Zebra Fish,Danio rerio)、非洲绿猴(Green Monkey,Cercopithecus aethiopes)15个种属来源的细胞,判断样本是否存在这15个种属间的交叉污染。
产品名称_中文名称 | 产品名称_英文名称 | 货号 | 作用种类 | 备注 | ||
两性霉素B, 250mg/ml | Amphotericin B | 03-028-1B | 真菌、酵母菌和霉菌 | 对新生隐球菌、白色念珠菌、组织胞浆菌、球孢子菌、酿母菌均具抑制作用 | ||
两性霉素B, 2500mg/ml | Amphotericin B | 03-029-1B | ||||
制真霉素, 10000units/ml | Nystatin Suspension | 03-030-1C | 真菌、酵母菌和霉菌 | 消化道念珠菌肠炎,口腔念珠菌感染 | ||
青链双抗(青霉素-链霉素) | Penicillin-Streptomycin | 03-031-1B | 对革兰氏阳性菌G+,革兰氏阴性菌G- | 葡萄球菌、链球菌、杆菌 etc. | ||
青链双抗(青霉素-链霉素) 10X浓缩 | Penicillin-Streptomycin | 03-031-5B | ||||
青链霉素,制真菌素三抗 | Penicillin-Streptomycin-Nystatin Solution | 03-032-1B | 真菌、酵母菌和霉菌、G+、G- | |||
青链霉素,两性霉素B三抗 | Penicillin-Streptomycin-Amphotericin B Solution | 03-033-1B | 真菌、酵母菌和霉菌、G+、G- | |||
青链霉素,新霉素三抗 | Penicillin-Streptomycin-Neomycin Solution | 03-034-1B | 真菌、酵母菌和霉菌、G+、G- | |||
硫酸庆大霉素溶液, 50mg/ml | Gentamicin Sulfate Solution | 03-035-1B | 对革兰氏阳性菌,革兰氏阴性菌,支原体 | |||
卡那霉素溶液, 10mg/ml | Kanamycin Sulfate Solution | 03-049-1B | 对革兰氏阳性菌,革兰氏阴性菌,支原体 |
人体表面平均带有103-106/cm2的微生物, 污染物可能由于操作人员及穿着的衣物带入。进出细胞房需穿着合适的实验衣, 尽量降低粉尘、皮屑及附带之微生物的扬起及掉落, 以免造成污染
人是带菌者,进细胞房应该:
勤更衣:无菌无尘衣穿过六小时后已于可在每平方公分中采集到个1-6个微生物
少讲话:口水中每毫升含107个微生物。应戴口罩操作
2015药典指导原则9205药品洁净实验室微生物监测和控制指导原则,里面有规定不同洁净等级的浮游菌和沉降菌的数量要求。
细胞房内绝对不可穿拖鞋或凉鞋, 以避免带入脚气霉菌。应该穿全包裹式鞋套,或专用鞋子。
1. 按要求细胞房应为封闭、正压、洁净房间(1-10级万洁净度) 。如受限于现况,可考虑医疗用移动式空气净化机,以净化空气。
2. 如担心污染物外泄,细胞房还应设计为相对负压。
3. 人员进出细胞房应有管制,经过培训才能进入操作,避免污染别人。
生物安全柜与超净工作台的高效滤网(HEPA filter)滋生细菌后反而容易成为污染源,良好的操作环境,才能确保细胞的健康。
Biological Industries(BI)可提供: 支原体/细菌/真菌污染预防喷雾剂Pharmacidal,Cat No.: IC-110100
定期更换生物安全柜与超净工作台HEPA滤网, 检测风速与测漏
Biological Industies(BI)可提供:
支原体/细菌/真菌污染预防喷雾剂Pharmacidal,Cat No.: IC-110100
2. 培养箱的温湿度非常适合微生物生长, 需定期消毒培养箱腔体与不锈钢隔架, 水盘用水需灭菌并加入抑菌剂, 杜绝霉菌真菌滋生。
Biological Industries(BI)可提供:
1. 支原体/细菌/真菌污染预防喷雾剂Pharmacidal,Cat No.: IC-110100
2. Aquaguard-1,Cat No.: 01-867-1B 100ml,有效消毒培养箱中的水盘
3. 选购可灭菌的二氧化碳培养箱,定期灭菌。
水浴锅中应加入无菌超纯水,并加入抑菌剂,可选用Biological Industries(BI):Aquaguard-2,Cat No.: 01-916-1E 50ml,有效消毒任何形式的水浴环境
2.品质不佳的胰酶也容易带入支原体或动物性污染源, BI所生产的胰酶经过辐射照射处理, 确保品质及有效杜绝支原体的引入。
3.临床培养可选用重组胰酶,以避免引入未知动物源病原体
一般胰酶保存方式, 建议15或50毫升分装后-20℃冻存、使用前必须37℃水浴或培养箱回温,胰酶消化后使用不含钙镁的缓冲液清洗细胞。
产品名称 | 货号 |
Trypsin Solution B (0.25%), without Calcium and Magnesium, without Phenol Red 胰蛋白酶(不含钙和镁,不含酚红,不含EDTA) | 03-046-1A |
Trypsin Solution B (0.25%), without Calcium and Magnesium, without Phenol Red 胰蛋白酶(不含钙和镁,不含酚红,不含EDTA) | 03-046-1B |
Trypsin Solution B (2.5%), 10X Conc., without Calcium and Magnesium, without Phenol Red 胰蛋白酶(不含钙和镁,不含酚红,10倍浓缩液) | 03-046-5B |
Crystalline Trypsin Solution (0.02%), without Phenol Red 水晶胰酶(不含钙和镁,不含酚红,不含EDTA) | 03-047-1A |
Crystalline Trypsin Solution (0.02%), without Phenol Red 水晶胰酶(不含钙和镁,不含酚红,不含EDTA) | 03-047-1B |
Trypsin EDTA Solution A (0.25%), EDTA (0.02%), with Phenol Red 胰酶(胰蛋白酶0.25%,EDTA0.02%) | 03-050-1A |
Trypsin EDTA Solution A (0.25%), EDTA (0.02%), with Phenol Red 胰酶(胰蛋白酶0.25%,EDTA0.02%) | 03-050-1B |
Trypsin EDTA (0.5%), EDTA 0.2% , 10X Conc, without Phenol Red 胰酶,不含酚红,10倍浓缩液 | 03-051-5B |
Trypsin EDTA Solution B (0.25%), EDTA (0.05%), with Phenol Red 胰酶(胰蛋白酶0.25%,EDTA0.05%) | 03-052-1A |
Trypsin EDTA Solution B (0.25%), EDTA (0.05%), with Phenol Red 胰酶(胰蛋白酶0.25%,EDTA0.05%) | 03-052-1B |
Trypsin EDTA Solution C (0.05%), EDTA (0.02%), with Phenol Red 胰酶(胰蛋白酶0.05%,EDTA0.02%) | 03-053-1A |
Trypsin EDTA Solution C (0.05%), EDTA (0.02%), with Phenol Red 胰酶(胰蛋白酶0.05%,EDTA0.02%) | 03-053-1B |
Trypsin EDTA Solution C (0.05%), EDTA (0.02%), without Phenol Red 胰酶(胰蛋白酶0.05%,EDTA0.02%,无酚红) | 03-054-1A |
Trypsin EDTA Solution C (0.05%), EDTA (0.02%), without Phenol Red 胰酶(胰蛋白酶0.05%,EDTA0.02%,无酚红) | 03-054-1B |
从正规供应商处购买以确保品质: 如渗透压、无菌等。
02-015-1ACS "Hanks' Balanced Salt Solution,With Calcium and Magnesium With Phenol Red HBSS平衡盐溶液(含钙,镁和酚红)"
02-023-1ACS "Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS), without Calcium and Magnesium DPBS(不含钙,镁和酚红)"
02-023-5A "Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS), 10X Conc., without Calcium and Magnesium DPBS缓冲液(不含钙,镁和酚红,10倍浓缩液)"
02-024-1ACS "Phosphate Buffered Saline (PBS), PH=7.4, without Calcium and Magnesium PBS(不含钙,镁和酚红)"
02-024-5ACS "Phosphate Buffered Saline (PBS), PH=7.4, without Calcium and Magnesium,10X Conc. PBS缓冲液(不含钙,镁和酚红,10倍浓缩液)"
细胞的状态如不佳, 可提高培养基内血清的比率, 隔天就更换培养基, 置换掉含有DMSO的培养基。也有可能有些细胞本身冷冻后存活率不佳或冷冻时的细胞數较少。如以上都有注意到, 就必须了解是否冷冻细胞时的手法有问题, 需注意是否程序性降温。
Biological Industries(BI)可提供:
1. 无血清细胞冻存液Serum-Free Cell Freezing Medium
, Cat No.: 05-065-1A/B
2. 无血清干细胞冻存液CryoStem Freezing Medium, Cat No.: 05-710-1D/
3. 无血清间充质干细胞冻存液MSC Freezing Solution, Cat No.:05-712-1D/E
已知抗生素对细胞有不同影响,如:
1. β-内酰胺类抗生素(青霉素)- 会影响蛋白质合成及抑制细胞增殖;
2. 氨基糖苷类氨基糖类(链霉素,卡那霉素,庆大霉素) - 会减少蛋白质合成,ATP水平降低,产生细胞毒性;
3. 内酯类(两性霉素B / fungizone,制霉菌素) - 干扰细胞膜,产生细胞毒性。
使用抗生素的时机:
1. 原代细胞培养时。因为在从组织分离时易带入污染;
2. 观察到,并且确认是微生物污染时(去除微生物后, 即应停用抗生素);
3. 尽量避免使用抗生素作为预防的方法
做为一种低概率事件,不同类型的耗材其未达到灭菌(即可能含菌)的概率从1/1000-1/1,000,000。
这种随机发生的低概率事件是最难追踪调查与预防的。
2. 塑料耗材从模具取下时可能会带下硅油,影响到细胞生长;
3. 大部分生产耗材车间不是洁净厂房,耗材有可能会夹带异物。
请考察并选用品质稳定、质量达标的耗材,并要求生产商提供测试数据报告
更换血清批号时:
1. 建议少量置换,1/3,1/2,2/3渐进式更换;
2. 或是提高血清比例增加营养让细胞更快速适应;
3. 一次采购足量血清避免经常更换批号;
4. 还须注意是否购买到仿冒的血清, 请务必从正规经销商购买, 如遇过于低廉的价格与不明通路都需提高警觉(未经过冷链全程运送)
Biological Industries(BI)有各式胎牛血清, 特殊加工工艺胎牛血清, 新生牛血清、成牛血清和其它物种血清(猪、马、羊、兔)等。
液态培养基: 使用不正确/不匹配培养基细胞仍可生长, 只是特性会改变。
培养基中常用的pH指示剂:酚红(phenol red),其实本身有微弱的雌激素(estrogen)作用,刺激有雌激素受体的细胞增殖。
BI有多种不同细胞专用无血清培养基系统, 及各式基础培养基, 请洽各地负责经销商或与技术支持部谘询
常见使用的添加因子如:细胞因子(Cytokine),这是一类小分子蛋白质或多肽类,这些因子可以帮助细胞的生长,促进细胞活化,直接参与免疫调节作用和其他细胞因子的形成,也是细胞与细胞之间讯息传递的重要桥梁。在正常生理况下细胞受到刺激后也会自然分泌,不同种类的细胞因子也会具有不同的免疫功能,然而过度的细胞因子分泌也可能会引发炎症反应,可直接、间接诱导或抑制细胞凋亡。
一此动物来源、组分複杂的添加剂,如Matrigel®,批间差比全合成或单一组分试剂大,使用时必须小心注意。
VivaCell 有各类科研与临床级别细胞因子、荷尔蒙、小分子化合物等, 请洽各地负责经销商或与技术支持部咨询
Vitrogel 与BioLamina均为合成与组分固定的试剂,实验结果更一致,重复性高。
BioLamina Vitrogel
如需长时间观察细胞, 如Live cell imaging, 可选用CELL Guidance Systems: LiveLightTM光稳定培养基系列:
1. MEMO培养基(取代DMEM), Cat No.: M06-100/M06-500
2. NEUMO培养基(取代Neurobasal), Cat No.: M07-100/M07-500
3. SOS补充剂(取代B-27), Cat No.: M09-20/M09-50
用470nm的光进行光遗传基因操纵实验。常规培养基(DMEM+SATO)内几乎所有OPC(oligodendrocyte progenitor cell,少突胶质前体细胞)都死亡,然而LiveLight培养基里的OPC细胞仍有良好活性。
Biological Industries(BI)可提供:
1. 长效型谷氨酰胺 L-Alanly-L-Glutamine, Cat No.: 03-022-1B
2. 各式细胞培养辅助试剂, 请洽各地负责经销商或与技术支持部咨询
3. hES 细胞株已被证实原位癌基因(TP53)随着代数增加更易有突变产生
参考文献: “Human pluripotent stem cells recurrently acquire and expand dominant negative P53 mutations” - Florian T. Merkle et al., Nature volume 545, pages 229–233 (11 May 2017)
为保障实验材料的一致性, 应将长期使用的细胞株建立细胞种子库(Seed Stock)与工作库(Working Stock)并定期安排身分鉴定
如果在继代的过程发现这样的细胞变多了, 表示细胞已老化。老化的细胞还不会立刻死亡, 而会随着继代一直留在细胞群之中,经过一些时间之后才会发生细胞凋亡(时间长的可以到一两年)。老化的细胞基因表达谱会产生变化, 建议从种子库或工作库重新复苏。
Dr. Cell可提供: 细胞老化检测(Cell Senescence Detection),Cat no.: T80500001
细胞老化检测可准确地判断出老化细胞的百分比,以决定是否要使用代数更低的细胞,以维持实验材料的一致性。
衰老细胞 正常细胞
掌握"慢冻快融"的原则,进行程序降温。
慢冻: 两种方法:
1.手动程序降温,将细胞依序放在4℃(30分钟)、-20℃(1小时)、-80℃(过夜)后移至液氮中保存。
2.程序降温盒,一般最广泛使用的降温法,为一种特制冷冻容器(填充异丙醇或依靠特制金属导热),使细胞以每分钟约-1℃的速度降至-80℃(过夜),然后移至液氮中保存。
快融:将冻存在液态氮中的细胞冻存管快速移至已37℃预热的水浴锅中(水面需低于管口,避免水分意外进入冻存管),使细胞冷冻悬液迅速融化;此做法能让细胞冷冻悬液快速通过-20℃~0℃这个结晶形成温度范围,使冻存时细胞外的冰晶迅速融化,避免冰晶进入细胞形成再结晶,对细胞造成二次伤害。
Biological Industries(BI)可提供:
1. 无血清细胞冻存液Serum-Free Cell Freezing Medium, Cat No.: 05-065-1A/B
2. 无血清干细胞冻存液CryoStem Freezing Medium, Cat No.: 05-710-1B/E
3. 无血清间充质干细胞冻存液 MSC Freezing Solution, Cat No.: 05-712-1B/E
细胞传代时, 要确实的执行细胞计数, 确保铺盘的密度。
尽量避免融合度过高, 融合度约达到80%即可分盘
Confluence 融合度: 在细胞培养中指的是细胞在培养表面(培养皿/瓶)所占的比例。